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Brahmaiah Meesaragandla, Yesaswini Komaragiri, … Mihaela Delcea

Weilin Lin, Malte Bonin, … Yixin Zhang

Anamika Avni, Ashish Joshi, … Samrat Mukhopadhyay

Yuri D. Ivanov, Tatiana O. Pleshakova, … Vadim S. Ziborov

Steven R. LaPlante, Valérie Roux, … Yann Ayotte

Didar Baimanov, Jing Wang, … Chunying Chen

A. Slapik y J. Spiechowicz

Shih-Ting Wang, Brian Minevich, … Oleg Gang

Thomas L. Moore, Dominic A. Urban, … Alke Petri-Fink

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 1227 (2023) Citar este artículo

La agregación de proteínas en bioterapéuticos puede reducir su actividad y eficacia.También puede promover reacciones inmunitarias responsables de efectos adversos graves.El impacto de los materiales plásticos en la desestabilización de proteínas no se comprende totalmente.Aquí, proponemos desconvolucionar los efectos de la superficie del material, la interfaz aire/líquido y la agitación para descifrar su papel respectivo en la desestabilización y agregación de proteínas.Analizamos el efecto de superficies de polipropileno, TEFLON, vidrio y LOBIND sobre la estabilidad de proteínas purificadas (albúmina sérica bovina, hemoglobina y α-sinucleína) y sobre un extracto celular compuesto por 6000 proteínas solubles durante la agitación (P = 0,1-1,2 W/ kg).El análisis proteómico reveló que las chaperoninas, las proteínas intrínsecamente desordenadas y los ribosomas eran más sensibles a los efectos combinados de las superficies de los materiales y la agitación, mientras que los pequeños oligómeros metabólicos podían protegerse en las mismas condiciones.Las observaciones de pérdida de proteínas junto con microscopía Raman, dispersión de luz dinámica y proteómica nos permitieron proponer un modelo mecánico de desestabilización de proteínas por plásticos.Nuestros resultados sugieren que la pérdida de proteínas no se debe principalmente a la nucleación de pequeños agregados en solución, sino a la desestabilización de las proteínas expuestas a las superficies del material y su posterior agregación en la interfaz aire/líquido cizallada, un efecto que no se puede prevenir con LOBIND tubosSe puede establecer una guía sobre cómo minimizar estos efectos adversos.Elimine uno de los componentes de este estrés combinado: material, aire (incluso parcialmente) o agitación, y las proteínas se conservarán.

El número de terapias basadas en proteínas está aumentando rápidamente.Sin embargo, las proteínas están expuestas a estrés durante la fabricación, lo que afecta su estabilidad.La agregación de proteínas en bioterapéuticos puede reducir su actividad y eficacia, pero también puede promover reacciones inmunitarias responsables de efectos adversos graves, como respuestas alérgicas y anafilaxia1.

Se han desarrollado varias estrategias para evitar la agregación de proteínas durante el procesamiento bioterapéutico, ya sea controlando cuidadosamente el entorno y el proceso locales o eliminando los agregados antes del muestreo.Los factores físicos y químicos que determinan la estabilidad de las proteínas o desencadenan su agregación han sido durante mucho tiempo objeto de investigación en los campos farmacéutico y bioquímico.Se sabe que la agitación, la temperatura, el pH y la fuerza iónica inducen la agregación de proteínas1,2,3.

El efecto de los materiales sobre la estabilidad de las proteínas en el procesamiento bioterapéutico se ha estudiado comparativamente menos.De hecho, la imagen actual ha sido durante mucho tiempo de pérdida mínima de proteínas por adsorción en superficies, donde las interacciones proteína/material solo darían como resultado la pasivación de la superficie sin afectar a las proteínas libres restantes en solución.Desde la década de 1970, Leo Vroman4,5 demostró que la adsorción de proteínas no era un proceso estático, sino dinámico en el que se producían intercambios en la interfase líquido-sólido entre las proteínas libres y adsorbidas en función de la concentración de proteínas y la afinidad por la superficie.Este modelo ahora puede completarse con la pérdida parcial de la estabilidad de la proteína luego de interacciones débiles con la superficie y la posterior liberación en la solución6, un primer paso para un efecto remoto de las interfaces.

Estudios recientes han demostrado que el efecto desestabilizador de las interfases sólido/líquido sobre la estabilidad de la proteína fue más profundo de lo que se creía inicialmente y podría mejorarse con la agitación.Ya se han descrito los efectos sinérgicos del flujo y las superficies sobre la agregación de anticuerpos7,8.Otros estudios enfatizaron el papel de las burbujas de aire9,10.Estas observaciones sugieren que tanto la interfaz sólido/líquido, aire/líquido y la agitación son elementos clave al considerar el efecto de un proceso o material novedoso durante la producción de productos bioterapéuticos.Sin embargo, falta la descripción mecánica que podría explicar los procesos involucrados y la interacción entre las diferentes interfaces y la agitación en la estabilidad de la proteína.Además, la mayoría de los estudios experimentales se realizaron con proteínas purificadas únicas, lo que no puede explicar el papel de las interacciones proteína-proteína cuando están involucradas diferentes proteínas, la posible asociación y disociación de complejos de proteínas en las interfaces11 y las variaciones en la sensibilidad de las proteínas a estos estreses.

Aquí, proponemos desconvolucionar los efectos de los diferentes jugadores (superficie del material, interfaz aire/líquido, agitación) para descifrar su papel en la agregación de proteínas.Extendimos este análisis de proteínas modelo purificadas a un extracto celular compuesto por miles de proteínas diferentes para identificar las proteínas más sensibles a este tipo de estrés combinado.

En este estudio, analizamos la desestabilización inducida por la superficie de proteínas purificadas y una mezcla compleja de proteínas solubles por contacto con superficies plásticas en solución acuosa.Se eligieron polipropileno (PP), polifluoretileno (PTFE o TEFLON) y un vial de vidrio de borosilicato de referencia, que son materiales comúnmente utilizados para el envasado de medicamentos y la manipulación de proteínas, para investigar el efecto combinado de las superficies y la agitación en la agregación de proteínas.También incluimos los tubos Protein LOBIND (EPPENDORF), que están diseñados para reducir la adsorción de proteínas en las superficies, con el fin de comparar los efectos observados con otros plásticos a este material.

En primera instancia, analizamos los efectos de la superficie plástica y la agitación en tres proteínas purificadas diferentes.Elegimos la albúmina de suero bovino (BSA), la hemoglobina porcina (Hb) y la α-sinucleína humana (α-syn) debido a sus diferencias en estructura y estabilidad térmica (consulte la tabla inf. S1 y S2).La Hb es una hemoproteína tetramérica ubicada en los eritrocitos que se une al oxígeno.Se clasifica como 'proteínas duras' según la definición de Norde de interacciones proteína-superficie debido a su estabilidad relativamente alta12.La BSA es una proteína circulante monomérica que transporta diferentes tipos de biomoléculas y fármacos en el torrente sanguíneo y que puede clasificarse como una “proteína blanda” debido a su capacidad de reorganizar su conformación tras la adsorción13.Se eligió α-syn por su tendencia a agregarse.La agregación de α-syn se ha asociado con la enfermedad neurodegenerativa de Parkinson14.Es una proteína intrínsecamente desordenada (IDP) que se encuentra parcialmente desplegada en su estado nativo.Luego, investigamos la agregación de proteínas con un extracto celular (YPE, extracto de proteína de levadura).Las proteínas solubles se extrajeron de Saccharomyces cerevisiae.YPE se construye a partir de miles de proteínas solubles con un alto rango dinámico y ha sido completamente caracterizado por proteómica15,16,17.

Las soluciones de proteína se mezclaron a 6 °C en tubos hechos de cada uno de estos 4 materiales unidos a una rueda giratoria para monitorear la pérdida de proteína en función de la energía mecánica y la potencia por masa de solución.La agitación impulsada por la gravedad mejorada se eligió para cuantificar con precisión la cantidad de energía suministrada a la muestra.La potencia, expresada en vatios por unidad de masa fluida, osciló entre 0,12 W/kg y 1,2 W/kg.Este diseño experimental nos permite aplicar los principios de Kolmogorov 18,19 para cuantificar el esfuerzo cortante en solución, mientras variamos el volumen de aire y líquido en las muestras.Estas condiciones imitan el estrés moderado (baja temperatura, pH neutro, fuerza iónica fisiológica) en presencia de dos interfaces diferentes (aire/líquido y sólido/líquido) con agitación, condiciones que se utilizan con frecuencia para la preparación y manipulación de proteínas.

El montaje experimental diseñado para monitorear la pérdida de proteína durante la agitación de la solución de proteína en tubos de PP, vidrio, TEFLÓN y LOBIND con una rueda giratoria se representa en la Fig. 1A.Todos los experimentos se realizaron en tampón fosfato 100 mM pH 7 a 6 °C.Primero, medimos la pérdida de proteína de proteínas purificadas en función del material del tubo con y sin agitación a 3 rpm (Fig. 1B).La concentración de proteína se midió después de la agitación para calcular la pérdida de proteína correspondiente.Se utilizaron espectroscopia de fluorescencia y UV-vis para medir las concentraciones iniciales y finales de BSA, Hb y α-syn, respectivamente.

(A) Esquema de la configuración experimental diseñada para medir la pérdida de proteínas durante la agitación de soluciones de proteínas purificadas con una rueda giratoria.La velocidad varió de 0 a 3 rpm, correspondiente a una potencia de 0 a 0,12 W/kg.Se utilizaron tubos de PP, vidrio, TEFLON, LOBIND.Se representa un tubo cónico de PP FISHERBRAND.(B) Pérdida de proteínas de soluciones de BSA, Hb, α-syn medidas en tubos de PP, vidrio, TEFLON y LOBIND después de 24 h a 6 °C sin (gris) y con agitación a 3 rpm (verde) en una rueda giratoria.La concentración de proteína inicial fue C0 = 0,1 g/L (V = 10 mL).Las diferencias significativas se determinan utilizando la prueba de "diferencia honestamente significativa" de Tukey realizada a partir del análisis de varianza (Anova) (*** valor de p < 0,001; ** valor de p < 0,01).Para observar el efecto de la naturaleza de la proteína, solo se muestran las diferencias a 3 rpm, todos los resultados estadísticos están disponibles en la Tabla S3.

La pérdida de proteína para las soluciones de Hb y α-syn se desencadena por agitación para todos los materiales probados, excepto para los tubos LOBIND.De hecho, no se midió ninguna pérdida de Hb (dentro del límite de detección) sin agitación para PP, TEFLON y vidrio, mientras que se midió una pérdida de Hb de hasta el 7 % con PP bajo agitación.De manera similar, se observó poca o ninguna pérdida de α-syn para todos los materiales (< 1 %) sin agitación, mientras que aumenta al 9 % con PP, TEFLON y LOBIND, y al 16 % con vidrio.Los diferentes niveles de pérdida de proteínas sugieren que la α-syn es más sensible a la desestabilización durante la agitación moderada en comparación con la Hb, y que este efecto puede potenciarse según el material.

Se observa una tendencia diferente para BSA ya que la pérdida de proteína sigue siendo similar con y sin agitación para los tubos de PP (3 %), TEFLON (< 1 %) y LOBIND (1–2 %).Por el contrario, se observa un efecto espectacular de la agitación cuando las soluciones de BSA están en contacto con el vidrio, con una pérdida de BSA que aumenta del 6 al 17 % con la agitación.

En general, las pérdidas de proteína observadas aquí para proteínas purificadas con agitación dependen tanto de la proteína como de la superficie.El nivel de pérdida de proteínas se puede clasificar como BSA < Hb < α-syn para PP, mientras que se observan diferentes tendencias para las otras superficies.Debido a que cada material exhibe un efecto diferente en términos de desestabilización de proteínas durante la agitación dependiendo de la naturaleza de la proteína, es necesario incluir un conjunto más grande de proteínas con diversas características físicas, químicas y estructurales para obtener una comprensión más realista y global de este proceso.

En segundo lugar, medimos la pérdida de proteína de una mezcla compleja de miles de proteínas solubles utilizando extracto de células de proteína de levadura (YPE).La pérdida de proteína se midió después de una agitación moderada de la solución de proteína durante 24 h a 6 °C en tubos de PP, vidrio, TEFLÓN y LOBIND en una rueda giratoria a una velocidad de 3 a 30 rpm.El YPE se trató con un cóctel de inhibidores de proteasa para evitar la degradación enzimática de proteínas.La concentración de proteína inicial y final se midió usando espectroscopia UV y se calculó el porcentaje de proteína perdida (Fig. 2).

(A) Esquema de la configuración experimental diseñada para medir la pérdida de proteínas durante la agitación de una solución de proteínas con una rueda giratoria.La velocidad osciló entre 3 y 30 rpm correspondientes a una potencia de 0,12 a 1,23 W/kg.Se utilizaron tubos de PP, vidrio, TEFLON, LOBIND.Se representa un tubo cónico de PP FISHERBRAND.(B) Pérdidas de proteínas medidas después de 24 h de agitación del extracto de células YPE a 6 °C y 3 rpm en cada tubo.La concentración de proteína inicial fue C0 = 0,1 g/L y el volumen de llenado fue del 60 %.El error corresponde a la desviación estándar de tres réplicas biológicas.Las diferencias significativas se determinan utilizando la prueba de "diferencia honestamente significativa" de Tukey realizada a partir del análisis de varianza (Anova) (*** valor de p < 0,001).

Las máximas pérdidas de proteína se observaron para los tubos de PP y de vidrio.También se observó una pérdida significativa de proteínas en los tubos TEFLON y LOBIND.Se midieron niveles más altos de pérdida de proteínas para YPE en comparación con Hb, BSA y α-syn en PP.Se observaron pérdidas significativas de proteínas en todas las condiciones de agitación a un nivel que no puede deberse únicamente a la adsorción de proteínas en las superficies del material.De hecho, las pérdidas máximas medidas en viales de vidrio corresponden a diez veces la masa mayor reportada por nuestro grupo para cubrir superficies de sílice usando la misma solución de extracto de proteína YPE17.Además, las pérdidas de proteínas fueron comparables entre el plástico LOBIND (7 ± 3 %) que se esperaba que no adsorbiera proteínas20,21 y el PTFE (5 ± 3 %) que se esperaba que fuera un fuerte aglutinante debido a las interacciones hidrofóbicas 22,23.Las pérdidas medidas no siguieron simplemente los valores de las tensiones interfaciales de las soluciones/materiales (estimadas a través de las mediciones del ángulo de contacto presentadas en la Figura S1) y no ocurrieron en ausencia de agitación (dentro de los errores experimentales, Tabla S4).Todas las observaciones sugieren que la pérdida de proteína está relacionada con la presencia de interfases sólido/líquido (S/L) y aire/líquido (A/L), y por lo tanto son más complejas que un simple fenómeno de adsorción en la superficie del material.

Debido a que PP indujo la mayor pérdida de proteínas, centramos nuestro trabajo experimental en este material ampliamente utilizado para comprender los procesos involucrados en la degradación de proteínas inducida por la superficie bajo agitación.Primero, variamos la energía inyectada en el sistema aumentando la velocidad de rotación de la rueda durante un tiempo fijo de 24 h (Fig. 2A).La pérdida de proteína aumentó con la energía suministrada al sistema, alcanzando valores tan altos como 45% cuando se aplicó una energía de 106 kJ/kg (correspondiente a 30 rpm).También monitoreamos la pérdida de proteínas en función de la potencia aplicada a una energía fija variando la duración de la rotación.La pérdida de proteína se duplicó para una energía recibida fija de 1,8 kJ/kg cuando la solución se mezcló durante 4 h a 3 rpm en comparación con 1 h a 12 rpm correspondiente a una potencia de 0,123 y 0,492 W/kg respectivamente (Fig. 3).

Evolución de la pérdida de proteína por YPE en tubos de PP en agitación en función de (A) la energía suministrada al sistema durante un tiempo fijo de 24 h y una potencia fija de 1,23 W/kg, (B) la potencia aplicada durante un tiempo fijo energía de 1,8 kJ/kg.Todas las muestras se mezclaron a 6 °C en una rueda giratoria.

El aumento de la pérdida de proteínas con la energía suministrada apunta a un efecto sinérgico del contacto con PP y la agitación sobre la agregación de proteínas inducida en la superficie.Esta observación ya fue reportada para otros tipos de materiales2.Sin embargo, la dependencia de la pérdida de proteína de la potencia aplicada a energía fija sugiere fuertemente que la turbulencia juega un papel en el proceso.

La concentración inicial de la solución de proteína también afecta la pérdida de proteína debido a la agregación inducida por la superficie (Fig. 4).Aumentó de 0,04 a 0,14 mg (aumento de 3,5 veces) cuando la concentración de proteína se multiplicó por 10 de 10 mg/L a 100 mg/L (Fig. 4).La meseta de saturación correspondiente a una pérdida máxima de proteína de 0,15 mg observada en las concentraciones de proteína iniciales más altas recuerda las isotermas de adsorción y destaca el papel de las interfaces en el proceso.

Efecto de la concentración inicial de proteína sobre la pérdida de proteína para el extracto de células YPE.(A) Pérdida absoluta de proteína en mg.(B) Porcentaje de pérdida de proteínas.Las muestras se mezclaron suavemente en tubos de PP en una rueda giratoria a 3 rpm durante 4 h a 6 °C.

Las proteínas podrían adsorberse en tres tipos diferentes de interfaces en los experimentos: la interfaz sólido/líquido (S/L), la interfaz aire/líquido (A/L) en la parte superior de la solución y la interfaz triple aire/sólido/líquido ( A/L/S) interfaz de línea en el menisco, todos los cuales se renuevan continuamente durante la mezcla (Fig. 5).El área de superficie específica de cada una de estas interfaces en nuestro sistema se evalúa, según la orientación del tubo, en 5–45 cm2 para la interfaz S/L, 1–14 cm2 para la interfaz A/L (en reposo) y 4 –23 cm para la interfaz A/L/S, según el volumen de solución y la orientación del tubo (vertical u horizontal) (Tabla 1).

Esquema que representa las tres interfaces consideradas durante la agitación de proteínas.(A) Interfase sólido/líquido en la superficie del material.(B) Interfaz aire/líquido.(C) Interfaz de línea triple aire/líquido/sólido que define el menisco.Las proteínas, representadas como puntos verdes, podrían adsorberse en una o varias de estas interfaces durante la mezcla.

Al variar la cantidad de solución en los tubos (y el volumen de aire correspondiente), comparamos el efecto relativo de cada una de estas interfaces para diferentes proporciones de superficie a volumen (Fig. 5, Esquema S1).La reducción de la cantidad de aire, aumentando así la relación de interfaz S/L en comparación con otras, reduce la pérdida de proteínas.Por otro lado, observamos que la renovación de la interfaz S/L conduce a una mayor pérdida de proteínas (Figura S3).Sugiere que la interfase S/L, una vez pasivada por las proteínas, tiene un efecto menor sobre la desestabilización de las proteínas en solución (Tabla 1) y que A/L y/o A/L/S son las interfases determinantes.Diferentes estudios 24 sugieren que la triple línea móvil A/L/S define una zona de fenómenos de secado complejos que pueden inducir fuertes fuerzas laterales25 y daño de 'corte' a las proteínas3.Para probar esta hipótesis, cambiamos la geometría del sistema y utilizamos una configuración de recubridor por inmersión con una placa de PP que se sumergió verticalmente y se retiró para reproducir la condición encontrada en los experimentos de agitación de la rueda giratoria en la línea triple A/L/S. interfaz (Esquema S2).Despreciamos la diferencia de curvatura de la superficie de PP en ambas geometrías, pero mantuvimos un período de movimiento que reproduce las condiciones de la configuración de la rueda giratoria.No se observó una pérdida significativa de proteínas en los experimentos de recubrimiento por inmersión (Tabla S5), al contrario de lo observado en el caso de las soluciones de insulina24.Por lo tanto, el secado en la zona de triple línea con PP ciertamente no es el proceso responsable de la pérdida de proteína medida en el experimento de la rueda giratoria.

Por lo tanto, podemos suponer razonablemente un papel menor de las interfaces S/L y A/L/S en el proceso de pérdida de proteínas para la agitación giratoria en contacto con PP.Por lo tanto, esperamos que la interfaz crítica sea probablemente la A/L.Tenga en cuenta que las deformaciones de la interfaz A/L en el experimento de recubrimiento por inmersión no parecen apropiadas para generar tensiones que agreguen proteínas a un nivel significativo (Esquema S2).Además, se observó muy poca pérdida de proteínas tras la agitación en tubos por encima de un volumen determinado de solución (aproximadamente el 75 % del volumen total) (Tabla 1).Por el contrario, se midió una mayor pérdida de proteína en todas las condiciones para Vsolución < 60%.Por lo tanto, la transición de la agregación de proteínas a la estabilización de proteínas, es decir, de condiciones de agitación estresantes a condiciones de agitación libres de estrés, parece bastante empinada y depende en gran medida de la relación Vsolución/Vaire.

Con base en la observación de los tubos durante la agitación giratoria de la rueda (Figura S6), podríamos describir este límite cualitativamente como la transición entre un estado de 'gas que se mueve hacia el líquido' a un estado de 'líquido que cae al gas'.Esto a veces se describe como la transición del flujo de pistón, donde se forman burbujas alargadas constantes, al flujo estratificado ondulado26.(Figura S7) El cambio en el patrón de flujo está asociado con la aparición de fluctuaciones en la cantidad de interfase A/L debido a la formación de ondas o burbujas.Es equivalente a eventos repetitivos de compresión/descompresión en las interfaces, que se sabe que son muy perjudiciales para las proteínas9,27.Este es probablemente el mecanismo clave en juego aquí.

También debemos discutir la posible interacción de turbulencias (Fig. 3) y de la naturaleza superficial del material (Fig. 2).Primero debemos notar que las fuerzas de cizallamiento turbulentas previstas (Tabla S7) son mucho más pequeñas que las fuerzas requeridas para desplegar proteínas, independientemente del tamaño de la proteína.Las fuerzas de cizallamiento en el sistema están en el rango fN (Tabla S7), mientras que se requieren decenas a cientos de pN para desplegar las proteínas28.Estamos considerando aquí un proceso de agitación suave.Sin embargo, el cizallamiento, incluso si no puede alterar la proteína directamente, puede tener dos efectos: (i) puede aumentar y disminuir transitoriamente la cantidad de interfase A/L (el comportamiento ondulado29) favoreciendo así la agregación en A/L;(ii) puede favorecer la desorción de proteínas nativas o desestabilizadas adsorbidas de las interfases S/L o A/L24,30.

El papel de la naturaleza del material superficial puede operar directamente a través de la adsorción de proteínas nativas, lo que lleva a la formación de sitios de nucleación para la agregación, o a través de la desestabilización de la proteína en solución, mediante una interacción favorable con las conformaciones desestabilizadas/desplegadas de la proteína6,31.

No podemos decir a partir de estos datos si el efecto de las turbulencias precede, sucede o actúa en paralelo al efecto del material.Para aclarar esto, realizamos un experimento adicional que involucró un exceso de superficie de plástico, en forma de un filtro de PP poroso con un área de superficie específica de 0,7 m2/g (Esquema S3 y Figura S2).Constituye una superficie de alta plasticidad expuesta a la solución proteica en ausencia de turbulencias.Con la interfaz S/L obtenida de 120 cm2 durante la agitación (en comparación con 50 cm2 durante la agitación sin filtro), la pérdida de proteína de YPE se duplicó y alcanzó el 40 % de la concentración inicial.(Cuadro S6).

Junto con la Figura S3, esto sugiere que la superficie del material inicia cierta desestabilización de la proteína que se ve potenciada por la combinación de la interfaz A/L y la turbulencia.La fuerza termodinámica no es la interacción entre el material y la proteína en su estado nativo (modelo de nucleación de Sluzky32), sino la fuerte interacción entre el material y la proteína en sus conformaciones desplegadas/desestabilizadas que cambia todos los equilibrios de plegamiento en solución.6 Esta situación es similar a otras tensiones, como la presión y la congelación, que se han descrito para inducir tales variaciones conformacionales 33 mediante ciclos microscópicos de asociaciones/disociaciones proteína-proteína.Por lo tanto, este modelo mecánico también explica por qué las superficies encerradas con bajas cantidades de interfaces A/L, como el filtro de plástico que se presenta aquí, o diseñadas para limitar la adsorción de proteínas, como el plástico LOBIND, también pueden desencadenar efectos desestabilizadores significativos en las proteínas en solución.

Una pregunta importante es qué sucede con las proteínas perdidas.Primero, determinamos si la pérdida de proteínas podría explicarse por el hecho de que las proteínas quedaran atrapadas en la superficie del material.En este caso, el grosor de la capa de proteína adsorbida debería aumentar con el número de ciclos para alcanzar la pérdida de proteína medida.Las proteínas adsorbidas en tubos de PP se eliminaron utilizando dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1 % v/v, un tensioactivo fuerte, y la cantidad de proteína correspondiente se midió mediante espectroscopia UV.La masa de proteínas adsorbidas en PP (en mg/m2) no aumentó significativamente en función de la velocidad de rotación (Fig. 6).Incluso disminuyó.También representa una cantidad relativamente pequeña (25 µg) en comparación con la pérdida total de proteínas de 150 µg, es decir, < 20 % de la pérdida total de proteínas.Por lo tanto, es poco probable que la adsorción de proteínas en la superficie del material por sí sola sea responsable de la pérdida de proteínas.Por lo tanto, centramos nuestro estudio en objetos recién formados en solución para comprender el destino de las proteínas perdidas.

Cantidad de proteínas adsorbidas en tubos de PP en mg/m2 en función de la velocidad de rotación para extractos de células YPE.La potencia (P) y la energía (E) se indican para cada condición.Las proteínas adsorbidas se eliminaron utilizando dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% v/v y la cantidad de proteínas se midió mediante espectroscopia UV.Las diferencias significativas se determinan utilizando la prueba de "diferencia honestamente significativa" de Tukey realizada a partir del análisis de varianza (Anova) (** valor de p < 0,01).

Se identificaron partículas grandes (d > 1 µm) en las soluciones de proteínas después de la agitación con rueda giratoria en tubos de PP.Se aplicó microscopía óptica usando luz reflejada y reconstrucción de contorno con el software Fiji para visualizar mejor su forma y estructura (Fig. 7A).El tamaño de los objetos oscilaba entre unos pocos y decenas de micrómetros, aunque no se podía ver ninguna estructura interna.

Imágenes in situ en solución y análisis bioquímico de los agregados proteicos.(A) Imágenes ópticas utilizando luz reflejada y reconstrucción de contornos.(B) Imágenes Raman de las partículas P2, P3.Las imágenes correspondientes a los espectros Raman del agregado de proteínas y la solución se muestran en rojo y verde, respectivamente.La superposición se muestra en la parte inferior.Se analizaron dos réplicas biológicas para cada condición.

Su composición bioquímica se analizó mediante microscopía Raman confocal (Fig. 7B).Las características Raman (ver atribuciones en la tabla S8) confirmaron la naturaleza proteica de las partículas, de acuerdo con la pérdida de proteína observada, con la posible presencia de ADN o ARN, lo que sugiere que las partículas podrían incluir ribosomas/nucleoproteínas.Estos datos sugieren que la agregación de proteínas es efectivamente responsable de la pérdida de proteínas, como se informó anteriormente en el caso de las inmunoglobulinas purificadas sometidas a compresión-descompresión periódica27,34,35.

Las imágenes Raman también revelaron un patrón ligeramente diferente en comparación con las imágenes de campo brillante con parches de núcleos de proteínas más densos y entradas de solución en las partículas.Para distinguir entre gelificación y agregación de proteínas, determinamos el nivel de hidratación de las partículas de proteína mediante microscopía Raman confocal.Los espectros Raman de las partículas en comparación con la solución de YPE circundante después de mezclar se muestran en la Fig. 8A.El contenido de agua de la muestra se refleja en la intensidad de la banda de vibración de estiramiento de OH del agua alrededor de 3400 cm−1.Aunque puede ser difícil comparar la intensidad absoluta de las bandas Raman, los espectros se tomaron aquí en las mismas condiciones experimentales y dentro de la misma muestra.La intensidad media de la banda de vibración OH de los agregados proteicos es sólo un 30% inferior a la de la solución circundante.Por lo tanto, las partículas de proteína que se formaron durante la mezcla en tubos de PP retuvieron un contenido de agua significativo, lo que sugiere que son partículas de proteína más parecidas a un gel que agregados compactos de proteína deshidratados y desnaturalizados.

Espectros Raman de agregados proteicos y solución YPE.(A) Espectros Raman promedio de agregados formados en solución de YPE a 0,1 g/L (rojo) y solución de YPE a 0,1 g/L después de mezclar (azul).Los espectros individuales de los agregados de proteínas se muestran en gris.(B) Espectros Raman normalizados de agregados de proteína formados en solución de YPE a 0,1 g/L (rojo) y solución madre de YPE a 25 g/L (verde).Los espectros se normalizaron a la banda OH del agua a 3406 cm−1.* Las bandas Raman que están presentes en la solución de YPE pero ausentes en los agregados de proteínas están resaltadas en gris.

Comparamos también los espectros Raman de las partículas formadas con el de la solución inicial de YPE (Fig. 8B).Sin embargo, tuvimos que trabajar con soluciones a una concentración más alta (25 g/L) para tener una buena relación señal/ruido para las proteínas libres (Figura S8).Los espectros de los agregados y la solución inicial muestran diferencias importantes, resaltadas en gris en la figura.Varias bandas bien visibles en la solución de YPE faltan en el espectro de las partículas, lo que muestra que algunos cofactores están excluidos del proceso de agregación (consulte la tabla S9), un efecto que también podría verse favorecido por los cambios estructurales de la proteína durante la agregación.Por el contrario, se observó poca diferencia entre los espectros Raman de varios agregados de proteínas aparte de su contenido de agua, lo que sugiere que las partículas formadas en este rango de tamaño tienen una composición relativamente homogénea (Fig. 8A).

En un segundo paso, buscamos intermediarios potenciales de crecimiento de partículas.Las soluciones se filtraron a 1,2 µm para eliminar los agregados grandes y se analizaron mediante dispersión de luz dinámica (DLS) después de 24 h con o sin mezcla.El radio hidrodinámico de los objetos en función de la velocidad de rotación se muestra en la Fig. 9. Curiosamente, se identificaron dos poblaciones distintas con un diámetro promedio de 10 y 130 nm en condiciones estables sin mezclarse.Dado que el extracto celular está compuesto por miles de proteínas diferentes, podemos suponer en primer lugar que estas dos poblaciones corresponden a proteínas libres y grandes complejos proteicos respectivamente.Esta distribución en dos poblaciones puede parecer a primera vista sorprendente.De hecho, la simulación a la escala del proteoma de las propiedades de difusión de las proteínas (que son, de hecho, los parámetros físicos medidos por DLS) no predice dos poblaciones36.Sin embargo, hay que tener en cuenta que los grandes complejos de transcripción son muy abundantes en las células que se dividen rápidamente, donde pueden representar hasta un tercio del contenido proteico37.Además de los ribosomas, datos recientes de espectrometría de masas sugieren que dos tercios de la proteína existen como “complejos separables” en extractos de células eucariotas38.Nuestra observación puede reflejar simplemente estos hechos.

Análisis del radio hidrodinámico de partículas formadas en solución de YPE después de mezclar en tubos de PP en una rueda giratoria en función de la velocidad.La distribución de tamaño de intensidad se midió por DLS después de la filtración de las soluciones a 1,2 µm para eliminar los agregados más grandes.El porcentaje de cada población (en intensidad) está codificado en color.

A 3 rpm, observamos un pequeño aumento en el radio hidrodinámico de los objetos más grandes que representan el 93% de las partículas en intensidad.A 30 rpm, tanto el tamaño como el número de objetos más grandes disminuyeron, mientras que el tamaño de los objetos pequeños no cambió significativamente.Estos resultados sugieren que no se formaron agregados con un diámetro de 100 nm < d < 1 µm en la solución.

La falta de agregado detectable de tamaño intermedio en todas las condiciones probadas (variación de volumen de solución: 0, 10, 15 mL y duración de la mezcla (hasta 53 h) es sorprendente. Sugiere que la agregación de proteínas no depende de un crecimiento progresivo en solución . En cambio, las partículas de proteína grandes parecen formarse directamente durante la agitación. Además, verificamos que no ocurría nucleación/crecimiento de partículas dentro de la solución mediante un experimento de siembra (consulte la información de apoyo de la Figura S5). La introducción en extractos de células frescas de solución ya envejecida, filtrado para eliminar partículas, o sin filtrar, de hecho no mejoró la degradación de la proteína.

Por lo tanto, sugerimos que las partículas se formen mediante un proceso de arrugado/envoltura a partir de las capas de proteínas de la interfase A/L.El tamaño de las partículas es comparable con la escala de longitud de Kolmogorov calculada39 (Tabla S7) que vincula la tasa de corte máxima y la dimensión de las partículas.Por lo tanto, el proceso de aglomeración que tiene lugar en una interfase macroscópica conduciría a agregados proteicos desprendidos del tamaño de micras a través de cizallamiento y turbulencias.

Proponemos un modelo global esquematizado en la Fig. 10, con una acción concomitante de adsorción sobre la superficie plástica y otras interfases, adaptado de Sluzky et al.32.En este esquema, los materiales de unión fuerte y los materiales de unión baja tendrían el mismo efecto al disminuir la diafonía entre la superficie del material y la solución (Fig. 10 paso A).De hecho, es lo que se observó para los tubos TEFLON y LOBIND con proteínas purificadas (Fig. 1) y extractos celulares (Fig. 2).

Adaptado de Sluzky et al.32.

Modelo de desestabilización de proteínas por contacto con superficies plásticas bajo agitación.(A) La afinidad de la superficie del recipiente por la proteína desplegada desestabiliza la proteína en solución a través de una deriva conformacional.Este proceso es más importante en el caso de interfaces A/L y S/L nuevas.(B) Las proteínas desestabilizadas se adsorben en la interfaz A/L.Las variaciones de la cantidad de interfase inducen fuerzas de compresión y descompresión, promoviendo la agregación de proteínas.(C) Las fuerzas de cizallamiento pueden facilitar la transferencia desde y hacia las interfaces en el paso A y romper las películas de proteínas formadas en el paso B.

El hecho de que se observe una pérdida significativa de α-syn independientemente de la superficie del material (pero con un efecto más fuerte con el vidrio, Fig. 1) no está en desacuerdo con el mecanismo presentado en la Fig. 10. De hecho, α-syn se despliega parcialmente en su forma nativa, por lo que no puede experimentar el efecto de desestabilización de la superficie de los materiales en la Fig. 10A.Por lo tanto, α-syn se desestabiliza principalmente por fuerzas mecánicas (Fig. 10, pasos B y C).

A partir de este esquema, la pérdida limitada de BSA observada en la Fig. 1 puede relacionarse con el uso muy común de soluciones de BSA para pasivar superficies plásticas por adsorción.De hecho, el efecto pasivante de BSA protegería al resto de la solución del efecto de desestabilización del material en la Fig. 10A.

La vulnerabilidad específica de BSA y α-syn en presencia de vidrio (Fig. 1) puede deberse a su punto isoeléctrico más bajo (ver Tabla S1) que promovería interacciones electrostáticas con la superficie del material.En este caso, no podemos excluir, además de la desestabilización de la superficie, la presencia en la superficie del material de sitios de nucleación de agregados40.

Con el fin de identificar las proteínas que son más sensibles al estrés impuesto, realizamos un análisis proteómico cuantitativo antes y después de la agitación del YPE en la rueda giratoria en tubos de PP, TEFLÓN, vidrio y LOBIND, utilizando las mismas condiciones que se muestran en Fig. 2. Las proteínas que se agotaron de la solución o se enriquecieron en la solución después de la agitación de YPE se identificaron mediante nanoLC-MS/MS (Fig. 11).Dado que la concentración de proteína total disminuyó después del estrés, tuvimos que inyectar un volumen mayor de solución de YPE para permanecer en el rango de sensibilidad óptimo para el sistema analítico de MS.Aplicamos un coeficiente de normalización correspondiente a la pérdida de las muestras calculado en escala de molalidad para inyectar la misma masa de proteínas.Los números dados por el análisis MS están en molaridad y una conversión adecuada de molaridad a molalidad sería, en principio, posible conociendo la distribución exacta en la concentración de la mezcla de proteínas analizada.Sin embargo, una proporción significativa de las proteínas identificadas tienen molaridades entre LOD y LOQ (5 fmol).Por lo tanto, estas proteínas se pueden observar pero no cuantificar y no se pudo aplicar la conversión de molaridad a molalidad (consulte el archivo de respaldo proteomic-SI1).Por tanto, como margen de seguridad, decidimos no considerar proteínas cuyas variaciones fueran del orden de la normalización aplicada.

Análisis proteómico cuantitativo de la proteína empobrecida y enriquecida en la solución después de mezclar YPE en tubos de PP, TEFLÓN, vidrio, LOBIND a 3 rpm durante 24 h a 6 °C.El gradiente de color indica el estado de las proteínas: empobrecido (rojo) a enriquecido (verde).Las características de la proteína se emiten a partir de la base de datos Uniprot41.En el archivo de apoyo Proteómica-SI2 se proporciona una lista de todas las proteínas consideradas.

Usando este método, identificamos 112 proteínas que exhiben una diferencia significativa en la concentración antes y después de la agitación en uno o varios de los materiales probados, según el análisis estadístico de Bayes (factor de Bayes> 1) (consulte el archivo de respaldo proteomic-SI2 para la lista de proteínas ).Entre estas proteínas, 58 proteínas estaban muy empobrecidas y 31 proteínas estaban muy enriquecidas, teniendo un umbral de variación de concentración mínima del 15% después de la mezcla.No se observaron diferencias significativas en función del material, observándose las proteínas más empobrecidas y más enriquecidas para todos los diferentes tipos de superficies.Las proteínas altamente enriquecidas y altamente empobrecidas se clasificaron como complejos, oligómeros, chaperoninas, proteínas parcialmente desplegadas o IDP y otras (Fig. 11).

Para validar el umbral del 15 % para clasificar selectivamente las proteínas enriquecidas y empobrecidas en los datos de MS, se realizó una prueba de simulación Monte-Carlo (ver M&M, Figura S9).

Durante las simulaciones, se aplicó no selectivamente a las proteínas un objetivo de pérdida de masa τ en el rango de 0 a 25 %, con un incremento del 1 %.Primero, calculamos los factores bayesianos (BFsim) para cada proteína del YPE completo usando una pérdida de masa objetivo de τ % para establecer si la diferencia en la cantidad entre el extracto completo y los conjuntos simulados agotados era significativa (BFsim > 1) o no. (BFsim ≤ 1).El agotamiento de una proteína determinada se evaluó utilizando una regla de decisión de votación por mayoría en 100 simulaciones.Las proteínas con abundancias bajas simuladas (cantidades < 5 fmol) se eliminaron de acuerdo con el LOD y el LOQ determinados experimentalmente.Los resultados de la simulación para la superficie de PP se muestran en la Fig. 12. La línea representa el número simulado de proteínas empobrecidas para lograr la pérdida de masa deseada.Para la superficie de PP, para lograr una pérdida de masa del 15 %, se necesitaban 125 proteínas que se agotaran de forma no selectiva, mientras que solo 58 están en el experimento.Nuestro análisis muestra también (información de apoyo parte SF) que aproximadamente el 80% de las proteínas empobrecidas identificadas experimentalmente por proteómica muestran un agotamiento más fuerte que las proteínas del conjunto de datos simulado.Estos dos resultados demuestran que los agotamientos de proteínas superiores al 15% en el sistema no se deben a un proceso aleatorio sino a un agotamiento selectivo del extracto.

Número calculado de proteínas empobrecidas en función de la pérdida de masa.El resultado de las simulaciones de Monte Carlo está representado por la línea verde.La pérdida de proteína medida y el número de proteínas empobrecidas identificadas por análisis proteómico para la superficie de PP se muestran con una cruz azul.

Las proteínas empobrecidas se dividen en tres grupos principales: proteínas parcialmente desplegadas (o IDP), chaperoninas y proteínas que forman grandes complejos (principalmente ribosomas).La detección de proteínas de las dos primeras categorías puede explicarse por el mecanismo de adsorción de proteínas en las interfases.De hecho, el proceso de adsorción a menudo implica un despliegue parcial de la proteína nativa que, de lo contrario, conlleva una penalización de entalpía asociada con su estructura secundaria, terciaria y cuaternaria.Por el contrario, las proteínas parcialmente desplegadas, como las IDP, no sufren esta penalización y, por lo tanto, se adsorben más fácilmente6,31.

También se espera que las chaperoninas se absorban fácilmente en las interfases, no directamente sino más bien después de la interacción con las proteínas desplegadas adsorbidas por las que exhiben una alta especificidad y afinidad.Tal mecanismo ya ha sido demostrado para superficies de sílice31.

La detección de complejos proteicos grandes (10-100 nm de diámetro), como las ribonucleoproteínas, es más sorprendente, ya que no suelen estar sobrerrepresentados en los experimentos de adsorción sobre superficies inorgánicas17.Por un lado, no se espera que el coeficiente de partición entre la interfase A/L sea mayor para las proteínas grandes en comparación con las pequeñas42.Los datos experimentales sugieren que incluso podrían ser menores43.Por otro lado, si las proteínas se consideran como esferas sólidas, entonces su comportamiento coloidal en solución depende de la polidispersidad, el hacinamiento y el confinamiento.Se demostró experimentalmente y mediante modelos que la difusión de proteínas grandes en las interfases se reduce en comparación con las pequeñas.Este mecanismo podría explicar un mayor tiempo de residencia y, por lo tanto, un mayor número de complejos de proteínas en la interfaz A/L, donde están sujetos a fuerzas de compresión y elongación que favorecen una mayor desestabilización y agregación44.

Las imágenes crioEM recientes de soluciones de proteínas grandes (de 25 nm de tamaño, comparables al tamaño de los complejos identificados aquí) demostraron una adsorción rápida y casi total en la interfaz A/L que resultó en una desnaturalización localizada45 y una disociación compleja46.Esta imagen sugiere fuertemente una distorsión/alargamiento de las proteínas interfaciales inducidas por fuerzas capilares (Esquema S4)47.Este efecto elastocapilar puede inducir la deformación de las proteínas a lo largo de la línea de contacto cuyo orden de magnitud, en el rango de nm (consulte la información de apoyo, parte SG) puede ser suficiente para romper los complejos, revelando superficies hidrofóbicas que son propensas a la agregación.Además, se espera que las fuerzas capilares favorezcan la fijación de partículas más grandes en la interfase A/L48 y su coalescencia49.

Una explicación complementaria radica en la compresión-descompresión periódica inducida por las ondas superficiales (Fig. 10)27,50 que se suman a las restricciones capilares.Cada vez que la superficie A/L disminuye, induce un aumento en la presión superficial de las proteínas adsorbidas en esta interfaz similar a la compresión obtenida en los experimentos de Langmuir.Al igual que las fuerzas capilares, las fuerzas de compresión dependen del tamaño de la proteína y pueden alcanzar un rango de 120 mN/m (consulte la información complementaria, parte SG).Esto es lo suficientemente fuerte como para poner en contacto proteínas grandes y enredarlas en la interfaz A/L51.Por lo tanto, estas fuerzas de compresión probablemente pueden favorecer la formación de partículas en la interfase.

Debemos considerar que estas fluctuaciones de presión serán más fuertes y frecuentes en condiciones de flujo ondulado, donde la cantidad de superficies varía rápidamente y la energía disipada en las estructuras proteicas (complejos, geles superficiales…) será entonces mucho mayor, debido a la intrínseca viscosidad de proteínas52,53 y de ensamblajes de proteínas54.En consecuencia, las condiciones de flujo ondulado probablemente amplificarán los procesos de desestructuración y entrelazamiento que ocurren en las interfaces.

Es de destacar que algunas proteínas estaban significativamente protegidas por los efectos de la agitación, entre las que se encuentran los homo-oligómeros metabólicos pequeños (Fig. 11).Se sabe que tales ensamblajes son más estables y menos propensos a la agregación55, aunque es difícil entender cómo las fuerzas de corte pueden estabilizarlos.Una explicación puede residir en el hecho de que tales complejos oligoméricos son cinéticamente estables11, es decir, se ensamblan más rápido de lo que se desensamblan.Sin embargo, en soluciones diluidas, su cinética de ensamblaje, que está controlada por el encuentro de los componentes de los complejos, se convierte en el factor limitante para su estabilidad.Cualquier fenómeno que pueda acelerar este encuentro, como el cizallamiento, puede favorecer su estabilidad.

Otra explicación sería que estos complejos se desorben preferentemente de las superficies por el efecto de cizallamiento de las turbulencias.En algunos casos, se ha descrito que el cizallamiento disminuye la cantidad de proteína adsorbida, especialmente en superficies hidrofóbicas30,56.Las proteínas que resisten la desorción inducida por cizallamiento forman islas en la superficie.Esto muestra que las interacciones laterales entre proteínas en la superficie son un mecanismo clave para la adsorción bajo cizallamiento.Los homo-oligómeros, debido a su estabilidad y superficies menos expuestas57, son menos propensos a tales interacciones y son desorbidos fácilmente por el flujo de agua.Por lo tanto, sería su adsorción limitada en la superficie bajo cizallamiento lo que finalmente los estabilizaría al exponerlos a los esfuerzos combinados descritos aquí.

Finalmente, comparamos nuestros resultados obtenidos con el extracto de células YPE con los datos sobre la estabilidad de BSA, Hb y α-syn purificados a la luz del modelo mecánico propuesto (Figs. 1 y 10).

A partir de los datos presentados en la Tabla S1, la mayoría de las personas consideraría que la Hb es más estable térmica y mecánicamente que la BSA, y mucho más estable que la α-syn.Sin embargo, la pérdida de Hb en presencia de PP, en los experimentos presentados en la Fig. 1, es comparable con la de α-syn y más importante que la de BSA.Por lo tanto, la Hb, clasificada como una proteína dura, parece comparativamente más sensible al estrés combinado discutido aquí que al térmico suave o al de cizallamiento puro.De hecho, se necesitan tres horas por encima de la primera temperatura de fusión de la Hb (50 °C) para lograr pérdidas del 5 %6,58, mientras que aquí se puede lograr con una energía (10 kJ) que, si se usara para calentar, solo conduciría a 2 °C de aumento del medio.Por el contrario, BSA parece menos sensible a la tensión combinada que a un cizallamiento puro, ya que se necesitan solo 20 min de tensión de cizallamiento en el rango de 1000 s−1 para lograr una pérdida del 4%59 que solo se observa aquí después de 24 h.

Incluso si hay menos datos disponibles sobre la estabilidad de YPE, también debemos notar que las proteínas ribosómicas y de unión a ARN identificadas en el YPE como las más sensibles al estrés combinado (archivo de apoyo proteómico-SI1 y SI2) también son las identificadas como la más termoestable a escala de proteoma60.

Nuestras observaciones sugieren, por lo tanto, que la escala de estabilidad tradicional de las proteínas, basada principalmente en estudios térmicos, no se puede aplicar a todos los tipos de estrés y que, en condiciones específicas, las proteínas descritas como "blandas y frágiles" pueden ser menos sensibles y de mayor duración. que los “duros y estables”.

En este trabajo, identificamos el efecto disruptivo de las interfases aire/líquido fluctuantes, potenciado por las interfases sólido/líquido y el esfuerzo cortante bajo agitación en soluciones proteicas complejas.Este efecto es más fuerte para los complejos de proteínas grandes, aunque también se ven afectadas las proteínas globulares pequeñas.Es lo suficientemente fuerte como para desencadenar la ruptura de proteínas como la hemoglobina, lo que lleva a la formación de agregados de proteínas similares a geles de tamaño micrométrico en extractos celulares.Como se requieren tantos efectos simultáneos para inducir la desestabilización de proteínas, puede parecer sorprendente que la desestabilización de proteínas ocurra con tanta frecuencia.Sin embargo, tal combinación es muy común en el manejo de proteínas.Todas las soluciones de proteínas se almacenan o analizan en recipientes de diversos materiales durante su producción o su purificación.Se pueden observar interfaces fluctuantes cuando se forman ondas, es decir, tan pronto como estos contenedores se mueven.Además, nuestras observaciones y el modelo mecanicista propuesto también brindan orientación sobre cómo minimizar estos efectos.Elimine uno de los componentes del estrés (material, aire (incluso parcialmente) o agitación) y las proteínas se conservarán.

Se prepararon extractos de proteína de levadura a partir de la cepa S288C (Matα SUC2 mal mel gal2 CUP1) de Saccharomyces cerevisiae61 con adaptaciones del protocolo descrito previamente15,16.Las células se cultivaron con agitación a 30 °C en un medio de levadura sintético definido (10 g L-1 de extracto de levadura Bacto, 20 g L-1 de peptona Bacto y 20 g L-1 de glucosa).Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía glicerol al 5 % y un cóctel de inhibidores de proteasa (sin EDTA 1X de THERMOFISHER SCIENTIFIC y PMSF 1 mM) y se rompieron con una prensa francesa.El extracto celular se centrifugó (4000 rpm, 15 min, 4 °C y 14000 rpm, 40 min, 4 °C) y se recuperó el sobrenadante que contenía proteínas hidrosolubles.La concentración de extracto de proteína de levadura se determinó utilizando la absorbancia de 205 nm con un coeficiente de absorción de 31 L g-1 cm-162.

Se preparó albúmina de suero bovino (BSA) utilizando polvo liofilizado comercial (SIGMA, A7030).Se disolvió en agua a una concentración de 30 g L−1, se dializó mediante membrana con corte de 3500 kDa y se centrifugó a 15 000 g durante 5 min a 4 °C.La concentración de BSA se determinó por espectroscopía de fluorescencia (excitación: 279 nm, emisión: 300 a 500 nm, ancho de hendidura 4 nm, volumen de la cubeta 200 µL).Se realizó una curva de calibración usando espectroscopia UV-visible (ver Tabla S1) para convertir la intensidad de emisión en concentración.Para la curva de calibración se realizaron 8 soluciones que contenían del 12,5 al 100% de BSA diluido con agua milliQ.La suma de la intensidad de la señal de 330 a 340 nm se calculó para cada muestra y se trazó como una regresión lineal para obtener la constante de proporcionalidad entre la intensidad de la señal y la concentración de BSA determinada por espectroscopia UV-visible.

La hemoglobina porcina (Hb) se purificó a partir de sangre de cerdo suministrada por el matadero de Harang, Houdan, Francia, con el acuerdo de la División Départementale de Protection des Populations de Francia.La sangre fresca se mezcló inmediatamente con una solución anticoagulante compuesta por ácido cítrico a 4,8 g L-1, citrato de sodio a 13,2 g L-1 y dextrosa a 14,7 g L-1 en agua Milli-Q (1:4 volumen de anticoagulante y sangre). ).La sangre se transportó a 4 °C y se purificó inmediatamente después de llegar al laboratorio.Primero se centrifugó la sangre (5000 g, 10 min, 4 °C) para eliminar el sobrenadante que contenía lípidos mediante aspiración al vacío.Se utilizó una solución de NaCl a 9 g L−1 para resuspender el sedimento con una varilla de vidrio para compensar el volumen removido manteniendo la fuerza iónica.La solución se centrifugó nuevamente (5000 g, 5 min, 4 °C) y se eliminó el sobrenadante.Este paso se repitió 3 veces.Los glóbulos rojos se hemolizaron por choque osmótico añadiendo 1:3 de volumen de agua Milli-Q a 4 °C.Se añadió tampón de fosfato 2,8 M pH 7,0 para precipitar las membranas a 4 °C.La solución se centrifugó (25.000 g, 20 min, 4 °C) y se recuperó el sobrenadante que contenía Hb libre.El sobrenadante se dializó 4 veces durante al menos 2 h en 40 volúmenes de agua Milli-Q a 4 °C a través de una membrana con un corte de 3,5 kDa.La solución dializada se centrifugó (25 000 g, 10 min, 4 °C).La solución se pasó a través de una resina AG 501-X8 para eliminar el 2,3-bisfosfoglicerato unido a la Hb y se centrifugó (14.000 g, 15 min, 4 °C).La solución de Hb purificada se mantuvo en tubos llenos y sellados para evitar la presencia de oxígeno y la oxidación de la Hb.Las soluciones se almacenaron a 6 °C durante una semana y se centrifugaron (16 000 g, 5 min, 4 °C) antes de su uso.La ausencia de metHb y la concentración de Hb se midieron mediante espectroscopia UV-vis (consulte la Tabla S1).

Para la preparación de α-syn, se transformaron células E. coli BL21(DE3) competentes con el vector de expresión pRK172 que codifica para α-syn de tipo salvaje humano, se sembraron en placas Petri de agar LB que contenían 200 mg/l de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C. .Las colonias transformadas se recuperaron en matraces de 6 × 1 L de medio de caldo LB que contenía 200 mg/L de ampicilina y se cultivaron a 37 °C con agitación (180 rpm).Cuando las células alcanzaron una densidad óptica de 0,6 a 600 nm, se indujo la expresión de α-syn mediante la adición de isopropil-β-d-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,5 mM y una incubación adicional a 37 °C y 180 rpm durante 3 h.

A continuación, las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 g durante 10 min a 4 °C, se resuspendieron en 200 ml de Tris-HCl 50 mM pH 7,5 que contenía PMSF 1 mM y 2 comprimidos completos de cóctel inhibidor de la proteasa sin EDTA (Roche) y se congelaron. a -80 °C.

Para la purificación de α-syn, las células se descongelaron en un baño de agua a 37 °C.Después de la adición de PMSF 1 mM y 2 comprimidos completos, las células se lisaron mediante sonicación en hielo utilizando un procesador ultrasónico Sonics Vibra cell 750 (40 % de amplitud, ciclos de sonicación de 20 s con pausas de 20 s para un tiempo de sonicación total de 300 s).Los extractos se centrifugaron a 40000 g durante 25 min y se recuperó el sobrenadante.Se añadió polvo de sulfato de amonio (50 % de saturación, es decir, 0,291 g/ml) a 4 °C con agitación para precipitar α-syn.Las proteínas precipitadas se sedimentaron a 5000 g durante 25 min a 4 °C y se resuspendieron en 400 ml de TrisHCl 50 mM pH 7,5 que contenía 2 comprimidos completos hasta la solubilización completa del sedimento.Se añadió polietilenimina al 0,05 % (Sigma) y la muestra se incubó durante 30 min en hielo para precipitar los ácidos nucleicos.A continuación, la muestra se centrifugó a 5000 g durante 25 min a 4 °C.El sobrenadante se cargó en una columna de intercambio aniónico XK 16/40 DEAE-Sepharose (GE Healthcare) (volumen de resina de lecho de 50 ml) equilibrada en TrisHCl 50 mM pH 7,5, KCl 20 mM, β-mercaptoetanol 1 mM.Tras lavar con 200 ml del mismo tampón, se eluyó con un gradiente lineal de KCl (20 mM–1 M, 300 ml a un caudal de 4 ml/min) y se recogieron fracciones de 4 ml y se almacenaron a -80ºC. ºC

Las fracciones de interés que contenían α-syn, identificadas por SDS-PAGE, se combinaron y calentaron a 95 °C durante 20 min para precipitar los contaminantes proteicos, mientras que α-syn permaneció soluble.

La muestra se centrifugó a 4000 g durante 20 min a 4 °C y se recuperó el sobrenadante.La concentración de α-syn purificado se determinó espectrofotométricamente (ver tabla S1).El α-syn puro se filtró a través de filtros de nitrocelulosa estériles de 0,22 µm, se dividió en alícuotas, se congeló rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C hasta su uso.Antes de los experimentos, se dializó α-syn contra agua y se usó en un tampón de fosfato 100 mM (pH 7,0).

Todos los experimentos se realizaron en un tampón de fosfato (100 mM, pH 7) en un cuarto frío (6 °C).Para cada experimento con extracto de células YPE, se midieron tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas para 27 mediciones.Se midieron tres réplicas para todos los experimentos con proteínas purificadas.El porcentaje de pérdida de proteína se presenta como el promedio y la desviación estándar.

Se estudió el efecto de la naturaleza del tubo a 0,1 g L−1 de proteínas.El volumen de líquido suele corresponder al 60% del volumen total del tubo.Se probaron cuatro materiales: polipropileno (PP) (tubos de centrífuga de 15 mL, FISHERBRAND), vidrio (PYREX), TEFLON (THERMOFISHER SCIENTIFIC), LOBIND (EPPENDORF).La superficie de cada recipiente fue de 50, 23, 85, 34 cm2 para tubos de PP, LOBIND, TEFLÓN y vidrio respectivamente.Se utilizó una tapa del mismo material excepto para los tubos de vidrio para los cuales las tapas tienen un recubrimiento de PTFE.Las soluciones de proteínas se mezclaron suavemente en una rueda giratoria de 25 cm de diámetro, a una velocidad de rotación fija durante 24 h.Las muestras de referencia se prepararon en las mismas condiciones pero no se sometieron a agitación.El efecto de la velocidad se estudió con una solución de 10 mL de extracto celular YPE (0,1 g L−1) en tubos de PP.Se fijó una velocidad constante a 0, 3 y 30 rpm durante 24 h.El efecto de la concentración de proteína se estudió con una solución de 10 mL de extracto celular YPE mezclando en tubos de PP a 3 rpm durante 4 h.La concentración inicial osciló entre 0,01 y 0,5 g L−1.El efecto de volumen se estudió con extracto de células YPE a 0,1 g L-1 en tubos de PP mezclando las soluciones en una rueda giratoria a 3 rpm durante 24 h.Se utilizaron cinco volúmenes de solución: 1, 3, 10, 12,5 y 15 mL.El efecto de secado se estudió mediante experimentos de revestimiento por inmersión.Se sumergió una membrana porosa de PP con un área de superficie total de 1 cm2 preparada a partir de un dispositivo de filtro desechable (0,45 µm, Puradisc 25 PP, WHATMAN) y se extrajo de una solución de 5 ml de YPE a 0,1 g L−1 usando un Dip Coater DC de KSV.La velocidad se fijó en 170 cm min−1 con un descanso de 20 s entre cada inmersión y retirada (1 cm).Los experimentos se realizaron bajo agitación magnética a temperatura ambiente durante 24 h en una cámara saturada de agua para limitar la evaporación.Sin embargo, se observó una ligera pérdida de líquido.Por lo tanto, se aplicó una corrección a la concentración de proteína medida.Las muestras de referencia se mantuvieron en el mismo entorno sin revestimiento por inmersión ni agitación magnética.Finalmente, se estudió el efecto de una superficie plástica adicional con una membrana porosa de PP (1 cm2) colocada en 10 mL de YPE a 0,1 g L−1 y mezclada durante 24 h a 3 rpm en una rueda giratoria.

Los experimentos de desorción se realizaron utilizando 10 mL de YPE a 0,1 g L−1 en tubos de PP.Se compararon tres condiciones: (i) se introdujo la solución y se aplicó directamente el protocolo de desorción;(ii) la solución se almacenó a 6 °C durante 24 h sin mezclar;(iii) la solución se mezcló a 3 rpm durante 24 h a 6 °C.El protocolo de desorción consiste en sumergir y llenar sucesivamente los tubos en dos vasos de precipitados que contienen 2,5 L y 1 L de agua respectivamente (120 s en cada uno).Usando este método, se evitó el secado de proteínas en la superficie.El factor de dilución total fue 4,106.Luego, se añadió a los tubos 1 mL de una solución que contenía dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,1% v/v y se mezcló a 3 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.Debido a que SDS disminuye ligeramente la absorbancia a 205 nm, las concentraciones de proteína se corrigieron usando una curva de calibración medida con SDS.La eficiencia de la desorción de proteínas al 0,1 % de SDS se verificó mediante la fluorescencia intrínseca de proteínas en fibras plásticas (consulte la Figura S4).

La longitud de la interfaz triple A/L/S se midió directamente en los tubos mediante análisis de imágenes.Para las muestras que contenían 1 y 15 ml de solución, el área de superficie de interfase A/L y L/S se determinó mediante cálculo de segmento circular.Para otros volúmenes, el menisco en la interfaz A/L podría despreciarse y el área de superficie de la interfaz A/L y L/S se midió mediante análisis de imagen.Los valores mínimo y máximo calculados corresponden a diferentes posiciones del tubo durante la mezcla (horizontal o vertical).

Los experimentos DLS se realizaron con un Zetasizer (MALVERN).Después de la filtración con filtro de 1.2 µm, se introdujeron 400 µL en las células y, luego de 200 s de equilibrio a 25 °C, se realizaron tres mediciones para tres réplicas biológicas a 25 °C.Los correlogramas se analizaron mediante un algoritmo REPES suministrado con el paquete de software GENDIST63,64 para obtener una distribución de intensidad de tiempos característicos.El radio hidrodinámico (RH) se calculó de acuerdo con la ley de Stoke-Einstein utilizando una viscosidad dinámica de 8,9 × 10–4 Pa s.

Los ángulos de contacto y las tensiones superficiales de YPE en los diferentes materiales se midieron con un Drop Shape Analyzer DSA 25 (KRÜSS) utilizando el software Advance Surface.Los ángulos de contacto se midieron con gotas sésiles.Se depositaron 5 µL sobre el sustrato y las medidas se procesaron usando un modelo elíptico después de 60 s de equilibrio.Las tensiones superficiales se midieron con gotas colgantes de 20 µL después de 180 s de equilibrio utilizando el modelo de Young-Laplace.Las tensiones superficiales medidas de las proteínas son 48,0 ± 0,7 mN/m para YPE 25 g L−1 y 54,6 ± 1,3 mN/m para YPE 0,1 g L−1.Los resultados corresponden a la media y desviación estándar de tres repeticiones.

Se tomaron imágenes de los agregados de proteínas directamente en solución mediante microscopía Raman confocal utilizando un instrumento WITec alpha300 RA (OXFORD INSTRUMENTS, Alemania).Se depositaron 10 µL de solución entre dos ventanas de sílice fundida (Esco Optics, EE. UU.) utilizando un espaciador Parafilm casero en una cámara de celda Attofluor cerrada (THERMOFISHER SCIENTIFIC, Francia).Se adquirieron imágenes Raman de áreas de 30 × 30 µm centradas en los agregados utilizando una longitud de onda de excitación de 532 nm, un objetivo de inmersión en aceite de 100 × (NA 1.3), una rejilla de 600 g/mm, una potencia de láser de 10 mW, un tiempo de exposición de 0,2 s y un paso de 0,3 µm .La imagen de campo brillante correspondiente se tomó en modo de reflexión con el mismo objetivo.Las imágenes Raman de los agregados de proteínas se midieron para dos réplicas biológicas.El análisis se repitió en al menos 2 agregados de proteínas para cada réplica biológica.Los espectros Raman de soluciones proteicas de 0,1 y 25 g/L se midieron antes y después de mezclar en una rueda giratoria utilizando una potencia de láser de 10 mW, un tiempo de exposición de 5 s y 10 acumulaciones.Se midió y promedió un mínimo de 5 espectros para cada muestra.La ausencia de daño por láser se controló mediante la acumulación de espectros individuales en el mismo lugar a la misma potencia.Los datos fueron tratados utilizando el software WITec Project Five.Los rayos cósmicos se eliminaban automática y manualmente.El fondo se sustrajo mediante ajuste polinomial (función de forma redondeada del software WITec).Las imágenes Raman se obtuvieron generando componentes espectrales a partir de la distribución de intensidad utilizando análisis de componentes automatizados y desmezcla espectral (True Component Analysis del software WITec).Se extrajo el espectro Raman promedio de cada componente.Las imágenes de campo claro y Raman se exportaron al software de Fiji.

Los tubos que contenían el 60% de su volumen máximo de YPE a 0,25 g L−1 en tampón fosfato (100 mM) se mezclaron durante 24 h a 3 rpm, 6 °C.La concentración se eligió para tener las condiciones óptimas para la detección y cuantificación.Los experimentos proteómicos se realizaron en la Plataforma de Análisis Proteómico de Paris Sud-Ouest (PAPPSO).Las muestras de YPE se depositaron en geles SDS-PAGE y las proteínas se separaron utilizando un tiempo de migración corto.Se aplicó un protocolo clásico de digestión de proteínas (descrito en ref65).Las muestras se analizaron mediante LC-MS/MS en un espectrómetro de masas Orbitrap Fusion Lumos Tibrid (THERMO SCIENTIFIC).La identificación de proteínas se realizó utilizando la base de datos de proteínas Saccharomyces cerevisiae cepa S288c (41, 6750 entradas, versión 2020).El método seguido se adaptó de 66 para obtener una cuantificación semiabsoluta.La cuantificación por debajo de 5 fmol no se consideró fiable.Las variaciones de la abundancia de proteínas se obtuvieron por comparación con una muestra de referencia expuesta al plástico, pero no agitada.Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium 67 a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD038266.

Para evaluar la especificidad de la proteína adsorbida en la superficie de polipropileno, desarrollamos el siguiente marco de simulación Monte-Carlo.De antemano, hicimos estas hipótesis: (1) si el efecto de agotamiento de masa no es específico, las proteínas en el extracto celular deberían agotarse uniformemente;(2) las abundancias de proteínas (Qabs) se estiman utilizando el método semicuantitativo descrito en66;(3) la variabilidad de la abundancia de proteínas utilizada para las simulaciones se estima utilizando las desviaciones experimentales de las cuatro réplicas técnicas.La estrategia de simulación general se muestra en la Figura S9.

El objetivo es generar cuatro réplicas, a partir de las cuatro muestras de cuantificación de escopeta YPE completa, que se agotaron hasta una pérdida de masa objetivo de τ %.Para cada proteína detectada por LC-MS/MS: (1) calculamos el índice Qabs semicuantitativo para cada una de las cuatro réplicas;(2) estas medidas de concentración se convirtieron en conjuntos de moléculas de tamaño N = Qabs x Avocoef donde Avocoef = 5,106 es un número similar a Avogadro;(3) estos conjuntos de moléculas (uno por proteína) se muestrearon aleatoriamente y el tamaño del conjunto disminuyó en una unidad.Este proceso de muestreo se repitió hasta que se obtuvo una pérdida de masa total de τ%.(4) Luego, los conjuntos de moléculas muestreadas hacia abajo se convirtieron de nuevo al índice Qabs semicuantitativo.(5) Para cada proteína, los valores de Qabs de las cuatro réplicas completas de YPE y las cuatro réplicas del conjunto de moléculas simuladas se compararon utilizando una versión bayesiana de la prueba t68.El proceso general, desde el paso 2 al 5, se repitió 100 veces.

El área superficial específica del filtro se midió mediante dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS).Los datos presentados corresponden a un promedio de 2 mediciones al vacío, realizadas en una configuración de cupper Xeuss 2.0 de XENOCS con tiempos de conteo de 3600 s y una distancia de muestra a detector de 2,5 m.

Los datos de proteómica de espectrometría de masas se han depositado en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD038266.Las listas completas de proteínas que muestran una diferencia significativa en la concentración antes y después de la agitación también están disponibles en SI (proteómica-SI1 y SI2).Los otros datos están disponibles de los autores correspondientes a pedido.

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Reconocemos la Plataforma Raman-AFM (MPQ, Université Paris Cité) financiada por ANR-18-IDEX-0001, IdEx Université Paris Cité.Agradecemos a Olivier Taché por su ayuda en las mediciones SAXS y a Karol Rakotozandriny por las imágenes de microscopía DUV.Los análisis de proteómica se realizaron en la plataforma PAPPSO que cuenta con el apoyo de INRAE, el consejo regional de Ile-de-France, IBiSA y CNRS y se archivaron en la plataforma ProteomeXchange.Este proyecto ha recibido financiación del Programa Nacional Francés de Investigación en Salud Ambiental y Ocupacional de Anses (2018/1/194).Este trabajo fue apoyado por una beca de doctorado supervisada por la CEA y la Région Pays de la Loire.

Universidad Paris-Saclay, CEA, CNRS, NIMBE, LIONS, 91191, Gif-Sur-Yvette, Francia

Marion Schvartz, Florent Saudrais, Stéphane Chédin, Serge Pin y Jean-Philippe Renault

Instituto de Moléculas y Materiales de Le Mans (IMMM), UMR 6283 CNRS, Universidad de Le Mans, Avenue Olivier Messiaen, 72085, Le Mans Cedex, Francia

Marion Schvartz, Thomas Perrault & Guillaume Brotons

Universidad Paris Cité, CNRS, Unidad de Biología Funcional y Adaptativa, 75013, París, Francia

Universidad Paris-Saclay, CEA, CNRS, Instituto de Biología Integrativa de la Célula (I2BC), 91198, Gif-Sur-Yvette, Francia

Jean-Christophe Aude, Stéphane Chédin, Laura Pieri & Yves Boulard

Universidad Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Instituto Micalis, PAPPSO, 78350, Jouy-en-Josas, Francia

Céline Henry & Aarón Millán-Oropeza

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JPR, YB, SP y GB participaron en el diseño del estudio y su implementación.MS y JPR escribieron el manuscrito.MS y FS realizaron experimentos de desestabilización.MS y TP analizaron los experimentos DLS.SD diseñó el análisis Raman.LP y FS prepararon las muestras de proteínas purificadas.MS y SC prepararon los extractos de proteínas totales.FS realizó el análisis de materiales.JCA, AMO y CH realizaron el análisis proteómico.Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Marion Schvartz o Jean-Philippe Renault.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Schvartz, M., Saudrais, F., Devineau, S. et al.Un estudio a escala de proteoma revela cómo las superficies plásticas y la agitación promueven la agregación de proteínas.Informe científico 13, 1227 (2023).https://doi.org/10.1038/s41598-023-28412-7

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28412-7

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Informes científicos (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (en línea)

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